Сыворотка диагностическая гриппозная (СДГ): грипп А (H3N2) Hong Kong 2671/2019 (с 15.07.2020 г.)

Сыворотка диагностическая гриппозная представляет собой антитела к вирусам гриппа типа А субтипов А(H1N1)pdm09, А(H5N1), А(H1N1), А(H2N2), А(H3N2), других антигенно актуальных субтипов и типа В, полученные из гипериммунных сывороток животных (коз, ослов, кроликов, крыс) или птиц (петухов), освобожденные от неспецифических ингибиторов гемагглютинации. Имеет вид аморфной массы белого или светло-желтого цвета.

НАЗНАЧЕНИЕ

Идентификация типов/субтипов вирусов гриппа А и В , выделенных из материалов от больных, изучение антигенной структуры вирусного гемагглютинина, контроль специфичности штаммов в составе гриппозных вакцин и диагностикумов.

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Материал для исследования

Материалом для исследования служит вируссодержащая жидкость из куриных эмбрионов или клеточных культур, зараженных материалами от больных, а также вакцинными или диагностическими штаммами вирусов гриппа.

Меры безопасности: все операции по взятию и обработке потенциально инфекционных клинических материалов от больных проводят в одноразовых перчатках и масках, после использования материалы от больных и контактировавшая с ними лабораторная посуда подлежат обработке 2% раствором лизоформина в течение 4 часов.

2. Приготовление рабочего разведения исследуемого вируссодержащего материала.

Исследуемый вируссодержащий материал осветляют центрифугированием при 2000-3000 об/мин в течение 20- 30 мин при комнатной температуре. В надосадочной жидкости определяют титр гемагглютининов. Для этого в микро планшете готовят последовательные разведения вируссодержащего материала на физиологическом растворе (ФР)*или фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,0-7,2 (ФСБ)** с коэффициентом 2, начиная с 1:10 до 1:280, в объемае 50 мкл. К каждому разведению добавляют по 50 мкл ФР или ФСБ и 100мкл 0,5% суспензии куриных эритроцитов (КЭ), предварительно трижды отмытых 10-тикратным объемом ФР. В 3-х контрольных лунках смешивают 100 мкл ФР/ФСБ и 100 мкл 0,5% суспензии КЭ. Смесь перемешивают постукиванием по краю
планшета и оставляют неподвижно на 30-40 мин при комнатной температуре. Реакцию учитывают после полного оседания КЭ в контрольных лунках планшета.

Критерии учета РГА:
+++ полная агглютинация эритроцитов в виде однородной взвеси или пленки на дне лунки
++ частичная гемагглютинация в виде однородной пленки на дне лунки, сочетающаяся с оседанием части эритроцитов в центре лунки
+ незначительная гемагглютинация в сочетании с оседанием эритроцитов в виде компактного осадка на дне лунки
0 отсутствие агглютинации эритроцитов, компактный осадок эритроцитов на дне лунки

НАПРИМЕР: если полная агглютинация эритроцитов наблюдается в разведении 1:320, титр вирусных
гемагглютининов (ГА) в составе данного вируссодержащего материала соответствует 1:320.

Единица ГА (ГАЕ) не является мерой измерения абсолютного количества вируса, но является «операционной» единицей, зависящей от методических особенностей титрования ГА (объемы реагентов, концентрация, вид эритроцитов и т.д.) Рабочее разведение исследуемого вируссодержащего материала - стандартизованный антиген (СА) - должен содержать 4 ГАЕ/50 мкл. Разведение антигена определяют делением титра гемагглютининов, который был определён в объёме 50 мкл, на 4.
НАПРИМЕР: при титре ГА 1:320, вируссодержащий материал разводят в 80 раз. (320:4=80). Для этого 0,1 мл материала добавляют к 7,9 мл ФСБ.

Контроль дозы стандартизованного антигена (СА) проводят «повторным» титрованием. При титровании СА в объеме 50 мкл с внесением в первую лунку 100 мкл неразведенного СА и приготовлением его двукратных разведений в последующих 5 лунках, полная агглютинация должна регистрироваться в первых 3 лунках планшета. Если СА не содержит 4 ГАЕ/50 мкл, он доводится до нужной дозы добавлением определённого количества ФСБ, если титр больше 4 или исходного материала, если титр меньше 4.

НАПРИМЕР: при титре ГА 1:320, вируссодержащий материал разводят в 80 раз. (320:4=80). Для этого 0,1 мл материала добавляют к 7,9 мл ФСБ.
НАПРИМЕР: если полная гемагглютинация наблюдается в 4 лунках (титр СА 1:8), приготовленный антиген следует развести в 2 раза. Наоборот, в случае, если агглютинация наблюдается только в 2 лунках, в приготовленный антиген необходимо добавить исследуемый вируссодержащий материал в том же количестве, что и при первичном приготовлении раствора.

После тщательного перемешивания контрольное титрование СА повторяют, доводя его концентрацию до 4 ГАЕ/50 мкл.
3. Постановка реакции торможения гемагглютинации (РТГА)
Содержимое ампулы с гриппозной диагностической сывороткой разводят ФР или ФСБ до объема указанного на этикетке; разведённую сыворотку разливают по 0,1 мл и хранят при температуре -20° С и ниже. Перед постановкой опыта готовят двукратные разведения сыворотки на ФСБ (от 1:10 до 1:640) в объеме 50 мкл. Для этого в 7-лунок каждого ряда вносят по 50 мкл ФСБ. В первую лунку вносят 50 мкл сыворотки, разведенной в 5 раз, и после 3-х кратного перемешивания, переносят 50 мкл разведенной сыворотки в следующую лунку. Процедуру повторяют, титруя сыворотку, а из последней 7-ой лунки избыток (50 мкл) разведенной до 1:640 сыворотки, сбрасывают. К каждому разведению сыворотки – начиная с 1:20, добавляют по 50 мкл рабочего разведения исследуемого вируссодержащего материала (СА). Панели встряхивают и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого в каждую лунку, включая три контрольные (одна –100 мкл сыворотки в разведении 1:10 и две - по 100 мкл ФСБ), добавляют по 100 мкл 0,5% КЭ.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Результаты реакции учитывают после оседания эритроцитов в контрольных лунках планшета (через 30-40 мин).

Критерием типовой принадлежности идентифицируемого вируса является четкая ингибиция гемагглютинации с одной из диагностических сывороток при отсутствии реакции с сыворотками (в разведении 1:20 и более) к другим типам вируса.

Пример типирования вируса:

В приведенном примере исследуемый материал содержит вирус гриппа типа В.

ФОРМА ВЫПУСКА
Препарат выпускают в ампулах/флаконах по 0,5 или 1 мл. Ампулы/флаконы упаковывают в коробки. Количество ампул/флаконов в коробке от 1 до 5. В коробку вкладывают Инструкцию по применению и нож ампульный.
СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ.

Срок годности - 2 года. Препарат с истекшим сроком годности применяться не должен.
Препарат хранят в соответствии с СП 3.3.2.028-95, с. 6 при температуре от 2 до 8°С.